動物骨髓單個核細(xì)胞分離液實(shí)驗(yàn)方法

 

技術(shù)文檔編號：TBD0024SOP

 

【產(chǎn)品規(guī)格】

 

200ml/Kit

 

【產(chǎn)品組成】

 

為方便廣大用戶使用，試劑內(nèi)容如下：

 

	名稱	產(chǎn)品編號	規(guī)格
A	XXXX 動物骨髓單個核細(xì)胞分離液		200ml
B	樣本稀釋液（贈品）	2010C1119	200ml
C	清洗液（贈品）	2010X1118	200ml
D	勻漿沖洗液（贈品）	F2013TBD	200ml
E	說明書		1 份

 

【實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備】

 

1.       適用儀器

 

*大離心力可達(dá) 1200g 的水平轉(zhuǎn)子離心機(jī)

 

2.       無菌硅化離心管

 

序號	產(chǎn)品名稱	產(chǎn)品貨號	規(guī)格
1	無菌硅化離心管/10ml（隨試劑盒附贈 5 支）	TUB2015	100 支/包

 

【骨髓單細(xì)胞懸液的制備】

 

1.       以適當(dāng)方式處死動物，剝離出股骨或脛骨，用剪刀剪斷骨頭兩端，露出內(nèi)腔。

 

2.       用注射器吸取適量（根據(jù)動物大小）的勻漿沖洗液（產(chǎn)品編號：F2013TBD）沖洗出內(nèi)腔中的骨髓。

 

3.       收集懸液到合適離心管中，反復(fù)吹打成單細(xì)胞懸液，以 70μm 細(xì)胞篩網(wǎng)（產(chǎn)品編號：TBDTM-SC，隨試劑盒附贈 5 個）過濾。

 

4.       450g，離心 10min，棄上清。

 

5.       用樣本稀釋液（產(chǎn)品編號：2010C1119）重懸細(xì)胞濃度為 2×10⁸–1×10⁹/ml 的單細(xì)胞懸液

 

備用（以小鼠為例，一般使用 1ml 樣本稀釋液重懸骨髓細(xì)胞）。

 

【檢驗(yàn)方法】

 

全過程樣本、試劑及實(shí)驗(yàn)環(huán)境均需在 20±2℃的條件下進(jìn)行。

 

 

1.       取一支適當(dāng)離心管，加入與骨髓單細(xì)胞懸液等量的分離液（注：分離液*少不得少于

 

3ml）。

 

2.       用吸管小心吸取骨髓單細(xì)胞懸液加于分離液液面上，400-500g，離心 20-30min。（注：根據(jù)骨髓單細(xì)胞懸液量確定離心條件，骨髓單細(xì)胞懸液量越大，離心力越大，離心時間越長，具體離心條件需客戶自行摸索，以達(dá)到*佳分離效果）。

 

3.       離心后，此時離心管中由上至下分為四層。**層為稀釋液層。**層為環(huán)狀乳白色單個核細(xì)胞層。第三層為透明分離液層。第四層為紅細(xì)胞層。

 

4.       用吸管小心吸取**層環(huán)狀乳白色單個核細(xì)胞層到另一 15ml 離心管中，向離心管中加入 10ml 清洗液（產(chǎn)品編號：2010X1118），混勻細(xì)胞。

 

5.       250g，離心 10min。

 

6.       棄上清。

 

7.       用吸管以 5ml 清洗液（產(chǎn)品編號：2010X1118）重懸所得細(xì)胞。

 

8.       250g，離心 10min。

 

9.       重復(fù) 7、8、9，棄上清后以 0.5ml 后續(xù)實(shí)驗(yàn)所需相應(yīng)液體重懸細(xì)胞。

 

分離圖例

 

 【注意事項(xiàng)】

1.    全過程樣本、試劑及實(shí)驗(yàn)環(huán)境均需在 20±2℃的條件下進(jìn)行。為獲得*佳的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，*好在取樣 2h 內(nèi)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，樣品存放時間越長，細(xì)胞分離效果越差。樣品放置超過 6h 后分離效果更差甚至不能達(dá)到分離目的。

2.    本實(shí)驗(yàn)*好不要使用高聚合材質(zhì)（如聚苯乙烯）的塑料制品，應(yīng)使用無靜電、低靜電心管及未經(jīng)堿處理過后的玻璃制品，因?yàn)殪o電作用將導(dǎo)致細(xì)胞貼壁、堿處理的玻璃表面會變成毛面，影響細(xì)胞分離效果。

      3.    吸取過多的單個核細(xì)胞層及分離液層會導(dǎo)致分離液交界處的粒細(xì)胞被吸出從而使混雜的粒細(xì)胞數(shù)量增加。

       4.    分離液用量大于骨髓單細(xì)胞懸液樣本時，分離效果更佳。

       5.    如實(shí)驗(yàn)后細(xì)胞得率或活性過低，請聯(lián)系天津?yàn)蠹夹g(shù)支持以尋求幫助，具體聯(lián)系方式詳見下方生產(chǎn)企業(yè)信息。

  【儲存條件及有效期】

    常溫保存，有效期 2 年。本品易感染**，需無菌條件操作。無菌條件下操作，啟封后置常溫保存。如 4℃保存，本分離液易出現(xiàn)白色結(jié)晶，影響分離效果。

【參考值（參考范圍）】

   本實(shí)驗(yàn)單個核細(xì)胞提取率及純度大于 80%。

【相關(guān)實(shí)驗(yàn)技術(shù)方案】

1.       骨髓沖洗單細(xì)胞懸液制備技術(shù)。

2.       所獲得單個核細(xì)胞的培養(yǎng)技術(shù)。

3.       所獲得單個核細(xì)胞的核酸提取技術(shù)。

4.       所獲得單個核細(xì)胞的鑒定方法A.流式細(xì)胞技術(shù)B.**組化技術(shù)

C.原位雜交技術(shù)

D.PCR 技術(shù)

【可能存在的問題及解決方法】

1.       由于血液粘度、細(xì)胞密度等差異可能造成的問題及解決方案如下表所示：

2.       本分離液分離細(xì)胞的原理為密度梯度離心，其密度與溫度、大氣壓等密切相關(guān)。不同地區(qū)客戶可根據(jù)當(dāng)?shù)厍闆r對離心條件進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。建議對離心條件進(jìn)行調(diào)整時，恒定離心時間，對離心轉(zhuǎn)速進(jìn)行調(diào)整。

3.       本分離液依照國際標(biāo)準(zhǔn)，全部使用藥用級原料，性能指標(biāo)與國產(chǎn)同類產(chǎn)品略有不同，可能出現(xiàn)紅細(xì)胞沉降不完全的情況，可以適當(dāng)加大離心轉(zhuǎn)速。

注：在對離心條件進(jìn)行調(diào)整時，離心轉(zhuǎn)速的加減以 50-100g 為基數(shù)，直至達(dá)到*佳分離效果，離心力*小不得小于 400g，*大不得大于 1200g。離心時間以 20-30min 為準(zhǔn)。